基于PCR扩增重组质粒的定点突变（site-directed mutagenesis）技术是一种制备基因定点突变的常用方法。在定点突变过程中，常常出现所扩增的质粒局部形成以定点突变引物对为重复单元（repeat unit）的短片段串联重复序列（简称VNTRs）。尽管网上有很多该现象的讨论，但多数被武断地认为是PCR扩增的假象，没有人对其生成机制做深入研究，故它们的分子生成机制至今不明。近日，哈尔滨医科大学医学遗传实验室周春水教授领导的研究小组对该短片段串联重复序列的产生机制给出了答案。

在制备抗衰老基因GPLD1的磷脂酶活性区点突变过程中，周春水研究小组发现，所产生的重组质粒约1/4含有以该磷脂酶突变引物对为重复单元的短片段串联重复序列，所有重复单元排列方向与GPLD1基因一致，拷贝数2-13不等，并且部分重复单元连接区存在碱基缺失、插入等突变现象。经过一系列仔细排查，他们锁定体外化学合成的突变引物对中含有少量起始于3’端的单链短引物（体外合成引物时的副产品），是短片段串联重复序列形成的起始因素。众所周知，定点突变引物对重组质粒进行体外PCR扩增时，所合成的新DNA链不能作为后续PCR扩增的模板。然而，起始于3’端的短引物引导合成的新DNA链就可以作为后续PCR扩增的模板。经过两轮扩增后，所扩增的新DNA链5’及3’端各含有一拷贝的定点突变引物，转化大肠杆菌后会形成含有两拷贝串联重复序列的重组质粒。这种3’端的短引物结合定点突变引物只能生成两拷贝串联重复序列。然而，该小组观察到大部分短片段串联重复序列的拷贝数均在两个拷贝以上，两拷贝以上的短片段串联重复序列又是如何在体外扩增中形成的呢？

PCR扩增反应中经常能产生引物二聚体，这些引物二聚体（含双拷贝引物对）能够继续引导并延伸上述两拷贝串联重复序列的拷贝数量。由于PCR引物二聚体连接区存在或多或少的碱基缺失，其引导所生成的重复单元的所有连接区均应该存在碱基缺失。但是，该研究小组发现一半以上的重复单元连接区为双链平末端连接，并不存在任何基因突变，这就排除了PCR引物二聚体在短片段串联重复序列产生中的主要作用。定点突变引物对由于正反链完全互补，能以双链形式存在于PCR反应体系中，这为DNA双链连接成引物二聚体提供了物质基础。由于化学合成的引物5’端缺少磷酸基团，两段双链引物并不能直接被连接。而生物中存在的非同源末端连接活性，既能够提供磷酸激酶活性，又能提供双链DNA连接酶活性， 既可生成平端连接引物二聚体，也可形成带有连接区基因突变的引物二聚体， 正是这些引物二聚体引导、延伸上述两拷贝串联重复序列的拷贝数量。那么非同源末端连接活性是从何而来呢？ 由于PCR所用Taq DNA聚合酶是基因工程产品，在其纯化富集过程中可能污染少量细菌中存在的非同源末端连接活性，该活性正是形成多种引物二聚体的真正原因。进一步测试表明，将Taq聚合酶预先热处理后，灭活非同源末端连接活性，再进行基因定点突变，该短片段串联重复序列的生成基本消失。

基于上述研究结果，周春水教授研究小组建立了半单元双拷贝引导法（half-double priming），用于重组质粒编码基因上生成短片段串联重复序列。该方法先以一条3’端起始的半重复单元长度单链引物，引导重组质粒的起始PCR扩增，再以一对双拷贝互补引物对（即含两拷贝重复单元），引导重组质粒的后续PCR扩增。该方法实施简便、无需后续复杂的基因克隆操作，阳性质粒比率高。所生成的串联重复序列，不仅重复单元方向一致、拷贝数可变，而且重复单元连接区之间不存在碱基突变，不会改变基因阅读框，非常适合在编码基因上生成短片段串联重复序列。

著名医学遗传学家、中国工程院张学院士认为，该项研究从实验中偶然发现的一种有趣现象出发，提出科学问题并且深入探究分子机制，所建立的半单元双拷贝引导法，为阐明短片段串联重复序列（VNTRs）与细胞衰老、肿瘤发生及多种神经退行性遗传疾病的关系提供了新型研究工具。该研究受到国家自然基金资助，研究结果“Mechanistic Characterization of De Novo Generation of Variable Number Tandem Repeats in Circular Plasmids during Site-Directed Mutagenesis and Optimization for Coding Gene Application”发表在2024年6月出版的《Advanced Biology》杂志上。周春水教授指导的研究生胡子琪、林国超为共同第一作者。半单元双拷贝引导法制备短片段串联重复序列已经申报国家发明专利。