基因扩增，包括双微体（double minutes, DM）或染色体外环状DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）和均匀染色区域（homogeneously staining regions, HSR），是体细胞基因组不稳定性的一种重要表现形式，并且已被广泛认为是对化疗等选择性压力的常见适应性反应。甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）作为一种广泛用于多种癌症治疗的药物，其疗效却常因癌细胞对其产生耐药性而受限。目前已知的MTX耐药机制包括药物运输或滞留缺陷、DHFR（二氢叶酸还原酶）翻译调控变化、DHFR基因扩增导致的活性增加，以及DHFR突变体对MTX亲和力的降低。癌症作为一种进化性疾病，其快速适应治疗的特性使得耐药性成为一个严峻的挑战。尽管深度测序和液体活检技术已被用于追踪肿瘤的体内演化，但为了更精确地描述耐药性的演化轨迹，仍迫切需要可靠的体外模型。

该篇文章于2024年4月9日在线发表于《Br J Cancer 》杂志（IF:8.8， 中科院一区），题目为“Dynamic genomic changes in methotrexate-resistant human cancer cell lines beyond DHFR amplification suggest potential new targets for preventing drug resistance. British journal of cancer”。该研究由孟祥宁等研究人员完成，她们建立了18个人结肠癌细胞系，这些细胞系表现出逐渐增加的MTX耐药性。研究团队运用细胞活性测定、实时定量PCR、基因组DNA提取、全基因组测序、拷贝数变异（CNV）分析等方法，深入研究了这些细胞系的基因组变化，并使用R软件进行数据分析，包括t检验、方差分析、相关系数计算和曲线拟合等。

研究结果揭示了MTX耐药性的基因组扩增经历了三个阶段：前扩增期、HSR期和ecDNA期。其中，DHFR基因表现出扩增和表达增加，特别是在ecDNA阶段。DHFR基因的表达是MTX耐药性的主要驱动因素，尽管DHFR的作用在早期阶段并不显著。此外，除了DHFR之外，MSH3、ZFYVE16和FAM151B等基因也在MTX耐药性中扮演了重要角色，尽管它们在ecDNA阶段的蛋白表达可能受到不同的转录后调控影响。研究表明，ecDNA在MTX耐药性中起着关键作用，并可能成为预防药物耐药性的新靶点。通过siRNA技术敲减特定基因后，研究人员发现这些基因的表达变化与MTX的IC50值显著相关，从而证实了它们在MTX耐药性中的重要作用。

MTX耐药性是一个复杂且持续变化的过程，不同阶段的基因组变化反映了不同的耐药性驱动机制。这项研究不仅增进了对MTX耐药性机制的理解，而且为开发针对ecDNA的个性化治疗策略提供了新的视角，有望帮助克服癌症对MTX治疗的耐药性问题。该项工作获得国家自然科学基金(No. 31771403 ，No. 81572915)、中国大学长江学者及创新科研团队计划(No. IRT1230)、黑龙江省自然科学基金 (No. LH2020H015)、哈尔滨医科大学少帅计划基金资助 (No. HMUMIF-21007)。 该项目受到英国Wellcome Sanger研究所的薛雅丽研究员和Chris Tyler-Smith研究员的大力支持和帮助。